Эксπир
Регистрация / Вход

Разработка эффективной технологии, позволяющей выделять значительные количества «стрессовых» (БТШ70) белков человека для использования их антисептических и противовоспалительных свойств

Стадии проекта
Предложение принято
Конкурс завершен
Проект закончен
Проект
02.512.11.2041
Организация
ИБК РАН
Руководитель работ
Евгеньев Михаил Борисович
Продолжительность работ
2007, 8 мес.
Бюджетные средства
4 млн
Внебюджетные средства
0,4 млн

Работы должны проводиться в рамках критической технологии «Геномные и посттеномные технологии создания лекарственных средств» Работы должны соответствовать по предполагаемому исполнению лучшим мировым стандартам. Создаваемый научно-технический задел должен обеспечивать в будущем проведение опытно-конструкторских и технологических работ на конкурентном уровне. Результаты работ должны способствовать дальнейшему инновационному развитию российских технологий в данном приоритетном направлении Программы.

Соисполнители

Организация
ИБФМ РАН

Этапы проекта

1
27.02.2007 - 31.05.2007
Проведен детальный анализ литературы, включая научные статьи, обзоры, патенты и дисертации по вопросам выделения и очистки белков теплового шока из различных источников. Разработаны и опробованы оптимальные протоколы для применения этих методов в работе над 2м этапом исследований по данному Государственному контракту.
Проведена работа по клонированию Hsp70 человека в бакуловирусной системе в клетках шелкопряда с максимальным содержанием Hsp70 для последующего выделения и очистки. Соисполнителем получены генетические конструкции, содержащие Hsp70 человека для экспрессии этого белка в B.subtilus.
Развернуть
2
01.06.2007 - 31.08.2007
Испытание генетических конструкций, содержащих (БТШ70 в разных экспрессионных системах. Провели анализ уровня экспрессии (БТШ70) в различных экспрессионных системах с использованием конструкций полученных на первом этапе проекта. В работе использовали следующие клеточные культуры для экспрессии БТШ70: бактериальные системы: E.coli B.subtilus; грибы Aspergillus niger, Penicillium canescense, и Pichia pastoris, а также культуру клеток шелкопряда (Spodoptera), где БТШ70 был экспрессирован в бакуловирусной системе. В качестве контроля везде использовали препарат БТШ70, выделяемый из мышцы быка. Недостатком препаратов, выделяемых из мышц млекопитающих, является то, что они состоят из двух форм Hsp70. Содержание индуцибельного белка (Hsp70) в препарате составляет приблизительно половину всего, а другую – конститутивный компонент данного семейства Hsp70. Помимо этого для потенциального использования в медицине следует иметь чистый, гено-инженерный и гомологичный (т.е. человеческий) Hsp70.
Выбор и обоснование принятого направления исследований и способов решения поставленных задач.
Клонирование и последующая экспрессия Hsp70 человека в клетках шелкопряда является логичным подходом для наработки чистого и гомологичного главного стрессового белка человека, для последующего использования в биологии и медицине. В настоящее время разработаны методы, позволяющие наращивать большие массы клеток шелкопряда, что позволит выделять необходимые количества белка, который на третьем этапе будет протестирован на его антисептические и другие защитные свойства.
Работа, проводимая соисполнителем (проф. А.С. Солонин ИБФМ РАН), является комплементарной нашим исследованиям. В случае удачи Hsp70 человека будет секретироваться из клеток B. subtilis, что позволит резко удешевить и увеличить его продукцию. Недостатком такого белка является его бактериальное происхождение, но в данном случае выбранная модель имеет свои преимущества перед E., поскольку эукариотические белки, выделяемые из B. subtilis, не загрязнены липополисахаридами.
В ходе работы над проектом была создана серия векторов , обеспечивающих эффективную экспрессию и секрецию чужеродных белков в клетках B. subtilis. Вектора содержат ориджин для репликации плазмид в клетках E. coli, области для интеграции в геном B. subtilis, генетические маркеры и промоторно-операторную область гена гемолизина II B. cereus с последовательностью, кодирующей сигнальный пептид этого белка, а также ряд удобных для клонирования сайтов рестрикции. Способность сконструированных векторов обеспечивать эффективную экспрессию чужеродных генов была проверена с использованием гена щелочной фосфатазы, лишенного собственного сигнального пептида. Показано, что ген щелочной фосфатазы, клонированный в сконструированной векторной системе, эффективно экспрессируется как в клетках E. coli, так и в B. subtilis. Однако, в первом случае в культуральную среду выплывает лишь 14 % белка, основная его масса ассоциирована с клеткой (очевидно, сосредоточена в периплазме). При экспрессии в B. subtilis более 90 % белка секретируется в культуральную среду, что подтверждает возможность эффективного использования данной экспрессионной системы для наработки чужеродных белков.
Попытка клонирования гена белка теплового шока человека в клетках B. subtilis с помощью созданной серии векторов на данном этапе не привела к успеху, что, вероятно, связано с токсичностью данного белка для клеток B. subtilis. На следующем этапе предполагается введение в созданные вектора мутантных форм регуляторного гена hlyIIR, обеспечивающих контролируемую экспрессию чужеродных генов.
Разработка векторов для экспрессии (и секреции) эукариотических белков из B. subtilis, проводимая соисполнителем (проф. А.С. Солонин ИБФМ РАН), может быть также очень полезна для экспрессии составных частей (пептидов) Hsp70, которые окажутся перспективными для медицинских целей.
Параллельно работам по клонированию Hsp70 человека завершено составление заявки для патентования векторов для секреции эукариотических белков из клеток B. subtilis.
Некоторые из предварительных результатов были включены в доклады сотрудников группы, работающей по проекту, на 3-м Всемирном Конгрессе по Стрессу (Будапешт, 23-26 августа 2007 г.).
Расчет ориентировочной экономической эффективности от внедрения новых методик выделения препаратов Hsp70 с ожидаемыми показателями НИР на основе научного прогнозирования на время разработки, освоения и срока морального старения выпускаемой продукции.
Приблизительные расчеты экономической эффективности были приведены в Техническом задании и в настоящее время по ходу ведущихся работ будут подтверждены или пересмотрены.
Развернуть
3
01.09.2007 - 31.10.2007
Проведен детальный анализ литературы, включая научные статьи, обзоры, патенты и диссертации по вопросам выделения и очистки белков теплового шока из различных источников. На основании протоколов, разработанных на 1-м этапе исследований по данному Государственному контракту проведена экспериментальная работа по использованию и сравнительному анализу различных методов экспрессии и очистки стрессовых белков человека (Hsp70).
В проводимых исследованиях анализировали количественные и качественные параметры экспрессии основного стрессового белка человека (Hsp70) в эукариотических клетках (бакуловирусная система, экспрессия в клетках шелкопряда) а также в различных прокариотических системах (E.coli и B.subtilus). В ходе этих работ разработаны оптимальные методики наработки главного стрессового белка человека.
Наработанный в клетках шелкопряда человеческий гено-инженерный белок (БТШ70) оказался наиболее дешёвым и чистым и использовался в различных клеточных системах. Было показано, что данный белок обладает ярко выраженными защитными антисептическими свойствами при испытании на ряде клеточных моделей. Исследования на двух животных моделях (крысы) показали, что этот белок спасает животных от гибели при сепсисе (заражение крови), а также резко улкчшает (нормализует все показатели гемостаза. В независимых исследованиях, проводимых с проф. Бобковой было показано, что данный препарат при интраназальном введении крысам с болезнью Альцгеймера нормализует поведение и другие параметры пораженных животных.
Развернуть

Программа

Программа "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2013 годы"

Программное мероприятие

1.2 Проведение проблемно-ориентированных поисковых исследований и создание научно-технического задела по технологиям в области наук о жизни
Продолжительность работ
2007, 8 мес.
Бюджетные средства
4,5 млн
Организация
ИОГен РАН
профинансировано
Тема
Работы по проведению проблемно-ориентированных поисковых исследований и созданию научно-технического задела в области живых систем по критической технологии «Геномные и посттеномные технологии создания лекарственных средств» (мероприятие 1.2 Программы)
Продолжительность работ
2007, 8 мес.
Бюджетные средства
72 млн
Количество заявок
43
Тема
Работы по проведению 2-ой очереди проблемно-ориентированных поисковых исследований и созданию научно-технического задела в области живых систем по критической технологии «Геномные и посттеномные технологии создания лекарственных средств» (мероприятие 1.2 Программы)
Продолжительность работ
2007 - 2008, 18 мес.
Бюджетные средства
70,4 млн
Количество заявок
27
Тема
Работы по проведению проблемно-ориентированных поисковых исследований и созданию научно-технического задела в области живых систем по критической технологии «Биомедицинские и ветеринарные технологии жизнеобеспечения и защиты человека и животных»
Продолжительность работ
2007, 8 мес.
Бюджетные средства
72 млн
Количество заявок
136
Тема
Работы по проведению проблемно-ориентированных поисковых исследований и созданию научно-технического задела в области живых систем
Продолжительность работ
2007, 8 мес.
Бюджетные средства
72 млн
Количество заявок
48
Тема
Работы по проведению проблемно-ориентированных поисковых исследований и созданию научно-технического задела в области живых систем по критической технологии «Технологии биоинженерии» (мероприятие 1.2 Программы)
Продолжительность работ
2007, 8 мес.
Бюджетные средства
72 млн
Количество заявок
49