Эксπир
Регистрация / Вход

Геномные и постгеномные технологии создания лекарственных препаратов болезни Альцгеймера

Стадии проекта
Предложение принято
Конкурс завершен
Проект закончен
Проект
02.512.11.2047
Организация
ИОГен РАН
Руководитель работ
Рогаев Евгений Иванович
Продолжительность работ
2007, 8 мес.
Бюджетные средства
4,5 млн
Внебюджетные средства
0,4 млн

Работы должны проводиться в рамках критической технологии «Геномные и посттеномные технологии создания лекарственных средств» Работы должны соответствовать по предполагаемому исполнению лучшим мировым стандартам. Создаваемый научно-технический задел должен обеспечивать в будущем проведение опытно-конструкторских и технологических работ на конкурентном уровне. Результаты работ должны способствовать дальнейшему инновационному развитию российских технологий в данном приоритетном направлении Программы.

Этапы проекта

1
27.02.2007 - 30.04.2007
1. Проведена модификация промоторной и регуляторной области (5’-области) для эффективной экспрессии в клетках млекопитающих последовательностей, кодирующих политопные белки (пресенилин 1 и IMPAC 1), имеющие несколько трансмембранных доменов.
2. Сконструированы мутантная форма гена пресенилина 1 с делецией 3-нетранслируемой области гена или с участком включающим 3- нетранслируемую область, а также следующие мутантные формы гена: D285A, T440D, T440V, (цифрами указаны положение на аминокислотной последовательности пресенилина 1; буквами обозначены аминокислотные замены, где D, A, T, V – аспарагиновая аминокислота, аланин, треонин, валин, соответственно).
3. Сконструированы экспрессионные вектора для трансфекции клеток млекопитающих, несущие нативную и мутантные формы гена пресенилина 1.
4. Получены культивируемые клетки почек эмбриона человека (HEK293), несущие генно-инженерные конструкции, содержащие нативную и мутантные формы гена пресенилина 1.
5. Получена серия мутантных изоформ IMPAC 1 белка: P317A, P317L, A318C, D265A (цифрами указаны положение на аминокислотной последовательности IMPAC 1; буквами обозначены аминокислотные замены, где P, A, L, C, D – пролин, аланин, лейцин, цистеин, аспарагиновая аминокислота, соответственно).
6. Проведена модификация 3’-области в последовательности гена IMPAC 1 белка, а именно, осуществлена замена 3-нетранслируемой области на последовательности-мишени (V5 и C-myc) для коммерчески доступных антител.
7. Сконструированы экспрессионные вектора для трансфекции клеток млекопитающих, несущие нативную и мутантные формы гена IMPAC 1.
8. Проведен сравнительный анализ экспрессии нативной и мутантных форм гена пресенилина 1 в культуре клеток. Показано, что пептиды-мишени (V5 и C-myc), вводимые в последовательность пресенилина 1 могут изменять его структуру и конформацию, и не могут использоваться в конструкциях для экспрессии и детекции пресенилина 1. В том время как последовательность гена пресенилина 1 с подобранными 5’- и 3’-участками эффективно экспрессируется в клетках НЕК293 и других клетках млекопитающих. Модифицированная последовательность пресенилина 1 с подобранными 5’- и 3’-участками предлагается для экспрессии в клетках млекопитающих.
9. Проведен сравнительный анализ экспрессии нативной и мутантных форм гена IMPAC 1 в культуре клеток. Показано, что пептиды-мишени (V5 и C-myc), введенные в последовательность IMPAC 1 не оказывают негативного влияния на детекцию нативной и мутантных изоформ IMPAC белка и его протеолитическую активность.
10. Получены модельные клетки, экспрессирующие последовательности: APP (белка-предшественник амилоида), несущую мутацию БА или без мутации; Notch 1 рецептора (белка - субстрата исследуемых протеаз - пресенилина и ИМПАС); HCV-фрагмента полипептида вируса гепатита с трансмембранным доменом – субстрата для ИМПАС 1.
11. Отработаны оптимальные условия работы с полученными поликлональными антителами к N-концевой последовательности белка IMPAC 1 с использованием антител очищенных с использованием хроматографических методов.
12. Разработаны и экспериментально проверены условия электрофореза в ПААГ для детекции пресенилина 1 и IMPAC 1 методами блот-гибридизации с помощью специфических антител.
13. Подготовлены тезисы доклада на Международную конференцию.
14. Составлен промежуточный научно-технический отчет.
Развернуть
2
01.05.2007 - 31.08.2007
1. Проанализированы продукты in vitro ε-расщепления белка АРР, экспрессируемого в трансфецированных клетках НЕК 293 совместно с нативной и мутантными формами пресенилина 1 в клеточных лизатах и мембранных фракциях.
2. Определена взаимосвязь между мутациями в гене пресенилина 1 и протеолитической активностью белка по отношению к субстрату АРР.
3. Проанализированы продукты in vitro S3-расщепления белка Notch 1, экспрессируемого в трансфецированных клетках НЕК 293 совместно с мутантными формами пресенилина 1 в клеточных лизатах и мембранных фракциях.
4. Определена взаимосвязь между мутациями в гене пресенилина 1 и протеолитической активностью белка по отношению к субстрату Notch 1 рецептору.
5. Проанализированы продукты γ-секретазного расщепления белка АРР – Аβ 40, Аβ 42 амилоидных пептидов, секретируемых клетками НЕК 293, экспрессирующими белок АРР совместно с нативной и мутантными формами пресенилина 1.
6. Определена протеолитическая функция ИМПАС 1 белка с использованием в качестве субстрата корового белка вируса гепатита С человека (HCV-core) с искусственно введенным эпитопом FLAG.
7. Проведено тестирование ингибирующей активности химических соединений и фармакологических препаратов на протеолитическую активность пресенилина 1.
8. Разработаны оптимальные условия для индукции и мониторинга внутри мембранного протеолиза АРР.
9. Разработана система анализа экспрессии и детекции белка предшественника амилоида (АРР) и продуктов его протеолиза в клеточных лизатах и мембранных фракциях, а также для рецептора Notch-1 – субстрата для пресенилина 1 и для полипептида корового белка вируса гепатита С с искусственно введенным эпитопом FLAG – субстрата IMPAC 1 белка,
10. Разработана система in vitro анализа продуктов протеолиза АРР белка в клеточных лизатах и мембранных фракциях.
11. Опубликована статья: Молекулярные основы болезни Альцгеймера (А.П. Григоренко, Е.И. Рогаев) в журнале «Молекулярная биология. 2007. Т. 41, №2. с. 331-345.
12. Подготовлены тезисы доклада на Международной конференции.
13. Составлен промежуточный научно-технический отчет.
Развернуть
3
01.09.2007 - 31.10.2007
1. Проведен отбор лекарственных препаратов и простых химических соединений, потенциально способных избирательно воздействовать на внутримебранную протеолитическую активность пресенилинов.
2. Определено влияние отобранных лекарственных препаратов и простых химических соединений на продукцию Aβ-40 и Aβ-42 пептидов с использованием модельной клеточной линии HEK293 App sw, стабильно экспрессирующей мутантный белок-предшественник бета-амилоида – App с альцгеймеровской мутацией Swedish.
3. Определено влияние исследуемых препаратов и соединений на возможное цитотоксическое и митогенное влияние на клеточной линии HEK293 App sw, стабильно экспрессирующая мутантный белок-предшественник β-амилоида – App с альцгеймеровской мутацией Swedish.
4. Проведен отбор специфических гамма-секретазных ингибиторов, гамма-секретазных ингибиторов с широким спектром действия, ингибирующих активность как пресенилинов, так и ИМПАС белков, а также ИМПАС-специфического ингибитора.
5. Исследовано влияние отобранных ингибиторов на развитие нематод С. elegans и показана из биологическая безопасность.
6. Исследовано влияние факторов роста и антиоксидантов на продолжительность жизни нематод С. elegans и показана их биологическая безопасность.
7. Разработана оригинальная тест-система на основе модели С. elegans для разработки, скрининга, оценки эффективности in vivo и биологической безопасности фармакологических препаратов, непосредственно влияющих на тонкие механизмы регуляции процессинга трансмембранных белков.
8. Составлен окончательный научно-технический отчет.
Развернуть

Программа

Программа "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2013 годы"

Программное мероприятие

1.2 Проведение проблемно-ориентированных поисковых исследований и создание научно-технического задела по технологиям в области наук о жизни
Продолжительность работ
2007, 8 мес.
Бюджетные средства
4,45 млн
Организация
ЦТП ФХФ РАН
профинансировано
Тема
Работы по проведению проблемно-ориентированных поисковых исследований и созданию научно-технического задела в области живых систем по критической технологии «Геномные и посттеномные технологии создания лекарственных средств» (мероприятие 1.2 Программы)
Продолжительность работ
2007, 8 мес.
Бюджетные средства
72 млн
Количество заявок
43
Тема
Работы по проведению 2-ой очереди проблемно-ориентированных поисковых исследований и созданию научно-технического задела в области живых систем по критической технологии «Геномные и посттеномные технологии создания лекарственных средств» (мероприятие 1.2 Программы)
Продолжительность работ
2007 - 2008, 18 мес.
Бюджетные средства
70,4 млн
Количество заявок
27
Тема
Работы по проведению проблемно-ориентированных поисковых исследований и созданию научно-технического задела в области живых систем
Продолжительность работ
2007, 8 мес.
Бюджетные средства
72 млн
Количество заявок
48
Тема
Работы по проведению проблемно-ориентированных поисковых исследований и созданию научно-технического задела в области живых систем по критической технологии «Биомедицинские и ветеринарные технологии жизнеобеспечения и защиты человека и животных»
Продолжительность работ
2007, 8 мес.
Бюджетные средства
72 млн
Количество заявок
136
Тема
Работы по проведению проблемно-ориентированных поисковых исследований и созданию научно-технического задела в области живых систем по критической технологии «Технологии биоинженерии» (мероприятие 1.2 Программы)
Продолжительность работ
2007, 8 мес.
Бюджетные средства
72 млн
Количество заявок
49