Эксπир
Регистрация / Вход

Разработка платформы высокопроизводительного скрининга для идентификации новых противотуберкулёзных лекарственных средств

Стадии проекта
Предложение принято
Конкурс завершен
Проект закончен
Проект
02.512.11.2048
Организация
ФБУН ГНЦ ПМБ
Продолжительность работ
2007, 8 мес.
Бюджетные средства
4,4 млн
Внебюджетные средства
0,5 млн

Работы должны проводиться в рамках критической технологии «Геномные и посттеномные технологии создания лекарственных средств» Работы должны соответствовать по предполагаемому исполнению лучшим мировым стандартам. Создаваемый научно-технический задел должен обеспечивать в будущем проведение опытно-конструкторских и технологических работ на конкурентном уровне. Результаты работ должны способствовать дальнейшему инновационному развитию российских технологий в данном приоритетном направлении Программы.

Этапы проекта

1
26.02.2007 - 30.06.2007
Аннотация
Объекты исследования – возбудитель туберкулёза, M. tuberculosis, ферменты биосинтеза НАД, аденилилтрансфераза НАМН (EC 2.7.7.18), ген Rv2421c и НАД-синтетаза (EC 6.3.5.1), ген Rv2438c.
Цель работы - разработка новой платформы на основе методов белковой инженерии, энзимологии и высокопроизводительного скрининга для поиска и оптимизации перспективных противотуберкулёзных препаратов – ингибиторов биосинтеза НАД, как одного из важнейших кофакторов, критичных для обеспечения жизнедеятельности возбудителя туберкулёза на всех фазах его жизненного цикла. Конечная цель данной разработки – создание новых препаратов на основе низкомолекулярных органических соединений, способных сократить время лечения, удешевить процедуру лечения и оказывать антибиотическое действие на все известные штаммы возбудителя туберкулёза, в том числе и мультирезистентные к существующим антибиотикам. В рамках новой платформы планируется 1) получение рекомбинантных ферментов биосинтеза НАД M. tuberculosis; 2) разработка методов детекции активности ферментов в последовательно-сопряжённом режиме (coupled-amplified assay), 3) валидация разработанной методики и её адаптация к формату высокопроизводительного скрининга; 4) разработка и валидация методики скрининга in vivo для определения MIC новых препаратов; 5) валидация разработанной платформы в рамках пилотных экспериментов по биоскринингу in vitro, in vivo и определения MIC избранных химических соединений.
Задачи первого этапа работы: 1) получение рекомбинантных ферментов НАД-синтетазы и НАМН-аденилилтрансферазы в виде индивидуальных очищенных белков и постановка методики определения их ферментативной активности на основе детекции флюоресценции флюорогенного красителя в сопряжённой ферментативной реакции; 2) разработка и валидация методики оценки действия ингибиторов – малых органических молекул на культуру M. tuberculosis c применением типа флюорогенного красителя идентичного тому, что используется для скрининга активных веществ in vitro на очищенных рекомбинантных белках.
Метод или методология проведения работы: методы генной инженерии, высокоэффективной жидкостной хроматографии, белковой химии, биохимической кинетики, микробиологии, флюоресцентной спектроскопии.
Результаты работы. Получены в виде гомогенных растворимых, ферментативно активных субстанций целевые рекомбинантные белки НАД-синтетаза и НАМН-аденилилтрансфераза микобактерий туберкулёза, определена и валидирована относительно последовательности ДНК прототипного патогенного штамма H37Rv первичная структура этих ферментов, проведён первичный анализ каталитической активности этих ферментов. Разработана методика высокопроизводительного скрининга библиотек малых органических молекул на основе детекции красной флюоресценции. Отработана методика флюоресцентного скрининга активности перспективных антибиотиков на культурах M. tuberculosis.
Область применения. Разработанные на данном этапе методологии могут применяться для высокопроизводительного скрининга ингибиторов ферментов биосинтеза НАД микобактерий туберкулёза in vivo и in vitro, а также для определения действия различных ингибиторов in vivo как на другие микобактерии, так и на различные микроорганизмы, включая широкий спектр социально значимых и особо опасных патогенов.
Экономическая эффективность или значимость работы. Значимость данного исследования состоит в том, что впервые в России проводятся инновационные исследования в области доклинической разработки противотуберкулёзных препаратов, призванных излечивать резистентные и мультирезистентные формы туберкулёза.
Развитие исследования после прохождения его первого этапа в рамках данного проекта будет заключаться в создании консорциума микробиологов, биохимиков, медицинских химиков, химиков-синтетиков для выполнения полного цикла доклинической разработки перспективных противотуберкулёзных препаратов, способных эффективно бороться с мультирезистентными формами туберкулёза, распространёнными, как в России и СНГ, так и за их пределами, и представляющими серьёзную угрозу, как здоровью населения, так и экономике России и сопредельных государств.
Развернуть
2
01.07.2007 - 31.10.2007
Получены генноинженерные рекомбинантные белки, продукты генов nadE и nadD M. tuberculosis, представляющие из себя NaMN аденилилтрансферазу и НАД - синтетазу патогена, соответственно. Разработана и оптимизирована система для выделения и очистки этих белков в растворимом и активном виде.
Осуществлён дизайн технологии детекции активности ферментов биосинтеза НАД, сходный с методологией, применяемой для прямой детекции антибактериальной активности низкомолекулярных органических веществ. Метод основан на реакции, в результате которой цикл окисления-восстановления синтезированного НАД используется для каталитического превращения флюорогенного красителя resazurin в интенсивно флюоресцирующий в дальнем красном диапазоне краситель resorurfin.
Проведена работа по оптимизации методики детекции и адаптации её к технологиям высокопроизводительного скрининга. Определена область линейности сигнала в зависимости от концентраций принципиальных ферментных и субстратных компонентов системы детекции. Оптимизирована концентрации флюорогенного субстрата для уменьшения гашения флюоресценции.
Отработана методика тестирования жизнеспособности M. tuberculosis при действии потенциальными антибиотическими препаратами на основе методики флуоресцентной детекции, аналогичной описанной выше (т.е. также на основе образования резоруфина из резазурина, но in vivo). Были оптимизированы параметры роста культуры, проанализирована зависимости воспроизводимости и уровня сигнала флуоресценции от типа планшетов, длительности культивирования патогена, и длительности взаимодействия культуры патогена с красителем. Определена токсичность различных концентраций ДМСО (как основного растворителя потенциально тестируемых соединений) для культуры патогена и изменение сигнала флуоресценции, вызванное ДМСО. Оптимизированная система детекции in vivo была валидирована с использованием стандартного антибиотического препарата (рифампицин) и подвергнута дальнейшей оптимизации на основе данных о действии стандартного антибиотика.
Выполнены эксперименты по определению бактерицидного/бактериостатического действия разрабатываемых противотуберкулезных препаратов. После определения интенсивности флюоресценции по методике тестирования жизнеспособности M. tuberculosis содержимое экспериментальных и контрольных лунок высевалось на чашки с плотной питательной средой Middlebrook 7H10. Учет роста культуры на чашках осуществлялся ежедневно в течение 28 суток. При бактериостатической активности тестируемых препаратов на чашках в течение этого срока появлялись колонии M. tuberculosis. При бактерицидной активности – колонии отсутствовали.
Оценку токсичности кандидатных веществ для эукариотических клеток и гомологичных эукариотических ферментов проводили на линии клеток НЕК 293. Выживаемость клеток после воздействия на них образцов химических соединений определяли по способности митохондриального фермента сукцинат-дегидрогеназы расщеплять тетразолиевую соль МТТ с образованием синего окрашенного продукта – формазана. Количество живых клеток оценивали по уровню восстановления 3-(4,5-диметилтиазол-2–ил)-2,5-дифенилтетразолий бромида. Оптическую плотность оценивали при длине волны 595 нм на спектрофотометре Пикон.
Разработка метода детекции активности кандидатных веществ с использованием моно- и мультирезистентных штаммов M. tuberculosis.
Отработана технология испытания кандидатных соединений на лабораторных животных. Для тестирования противотуберкулезной активности кандидатных соединений in vivo использовали модель гематогенно-диссеминированного туберкулеза у мышей BALB/c (самки, вес 20 г). Контрольным препаратом служил изониазид. Лечебная доза изониазида - 25 мг/кг веса животного. Количество животных в каждой группе – 10 штук.
Таким образом, была разработана и оптимизирована комплексная система для выскопроизводительного скрининга ингибиторов ферментов биосинтеза НАД M. tuberculosis in vitro и in vivo.
Развернуть

Программа

Программа "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2013 годы"

Программное мероприятие

1.2 Проведение проблемно-ориентированных поисковых исследований и создание научно-технического задела по технологиям в области наук о жизни
Продолжительность работ
2007, 8 мес.
Бюджетные средства
4,5 млн
Организация
ИОГен РАН
профинансировано
Продолжительность работ
2007, 8 мес.
Бюджетные средства
4,45 млн
Организация
ЦТП ФХФ РАН
профинансировано
Тема
Работы по проведению проблемно-ориентированных поисковых исследований и созданию научно-технического задела в области живых систем по критической технологии «Геномные и посттеномные технологии создания лекарственных средств» (мероприятие 1.2 Программы)
Продолжительность работ
2007, 8 мес.
Бюджетные средства
72 млн
Количество заявок
43
Тема
Работы по проведению 2-ой очереди проблемно-ориентированных поисковых исследований и созданию научно-технического задела в области живых систем по критической технологии «Геномные и посттеномные технологии создания лекарственных средств» (мероприятие 1.2 Программы)
Продолжительность работ
2007 - 2008, 18 мес.
Бюджетные средства
70,4 млн
Количество заявок
27
Тема
Работы по проведению проблемно-ориентированных поисковых исследований и созданию научно-технического задела в области живых систем
Продолжительность работ
2007, 8 мес.
Бюджетные средства
72 млн
Количество заявок
48
Тема
Работы по проведению проблемно-ориентированных поисковых исследований и созданию научно-технического задела в области живых систем по критической технологии «Биомедицинские и ветеринарные технологии жизнеобеспечения и защиты человека и животных»
Продолжительность работ
2007, 8 мес.
Бюджетные средства
72 млн
Количество заявок
136
Тема
Работы по проведению проблемно-ориентированных поисковых исследований и созданию научно-технического задела в области живых систем по критической технологии «Технологии биоинженерии» (мероприятие 1.2 Программы)
Продолжительность работ
2007, 8 мес.
Бюджетные средства
72 млн
Количество заявок
49