Эксπир
Регистрация / Вход

Клеточная терапия генетически модифицированными стволовыми клетками пуповинной крови трансгенных G93A мышей, экспрессирующих фенотип бокового амиотрофического склероза

Стадии проекта
Предложение принято
Конкурс завершен
Проект закончен
Продолжительность работ
2007, 8 мес.
Бюджетные средства
4,13 млн
Внебюджетные средства
0,37 млн

Работы должны соответствовать по предполагаемому исполнению лучшим мировым стандартам.
Создаваемый научно-технический задел должен обеспечивать в будущем проведение опытно-конструкторских и технологических работ на конкурентном уровне.
Результаты работ должны способствовать дальнейшему инновационному развитию российских технологий в данном приоритетном направлении Программы.

Этапы проекта

1
27.02.2007 - 30.06.2007
Произведен анализ литературы и патентные исследования по молекулярным и клеточным аспектам трансфекции клеток пуповинной крови и использованию генетически модифицированных клеток в лечении нейродегенеративных заболеваний. Создана рабочая исследовательская группа (22 человека). Произведены закупки оборудования. Отработаны методы получения мононуклеаров из пуповинной крови, а также методы трансфекции и варианты доставки клеток непосредственно в ЦНС. Через питомник лабораторных животных «Пущино» приобретены генетически модифицированные G93A мыши. В питомнике получено потомство, сформированы ядра и проведено их генотипирование. Выбрано направление исследований. Исследовательская группа готова к выполнению 2 этапа «Экспериментальные исследования».
Развернуть
2
01.07.2007 - 30.09.2007
В ходе выполнения второго этапа работ были проведены экспериментальные исследования по отработке и поиску оптимальных методов получения чистой фракции мононуклеаров из пуповинной крови человека. Параллельно, исходя из задач исследования, в полном объеме были проведены работы в области генной инженерии (дизайн праймеров, клонирование и секвенирование), наработаны препаративные количества плазмид для трансфекции мононуклеаров. Проведен анализ эффективности нуклеофекции методом электропарации и липофильной трансфекции, в результате которого было установлено, что более эффективным является метод электропарации, и отработаны оптимальные условия проведения трансфекции. Нативные и генетически модифицированные клетки, трансфецированные генами EGFP и L1CAM+VEGF, трансплантировали мышам G93A c фенотипом бокового амиотрофического склероза и крысам после частичной гепатэктомии. Ксенотрансплантация нативных и генетически модифицированных мононуклеаров не вызывала посттрансплантационных осложнений и реакции отторжения трансплантата. Проводится оценка терапевтического эффекта, в частности хоуминга и дифференцировки трансплантированных клеток у крыс. С целью выявления терапевтического эффекта трансплантации на продолжительность жизни G93A мышей животные будут выведены из эксперимента в терминальной стадии болезни с последующим анализом хоуминга и дифференцировки трансплантированных клеток. Экспериментальные исследования второго этапа НИР подтверждают правильность выбранного направления исследования и перспективы разработки методов клеточной терапии генетически модифицированными мононуклеарами пуповинной крови.
Подана заявка и объявлены торги на конкурсной основе на приобретение материалов (реактивы). Оплата товаров по данной заявке будет проведена после завершения торгов, объявления результатов конкурса и заключения контракта с фирмой-победителем. Информация по торгам размещена на сайте www.zakupk.gov.ru
Согласно договору № 249/07-Т от 18 июля 2007 г. проведена оплата услуг питомника лабораторных животных «Пущино» при филиале института биоорганической химии РАН за разведение и генотипирование трансгенных G93A мышей.
Развернуть
3
01.10.2007 - 31.10.2007
1) Проведены патентные исследования и анализ литературы с использованием всех открытых Российских и международных баз данных научной литературы и баз данных патентных организаций США, Европы, Японии, Канады и других стран. Результаты исследований позволили заключить, что выбранное направление исследований является инновационным и имеет высокие шансы на получение патентоспособных интеллектуальных и практических разработок с последующей возможностью внедрения в клиническую практику для лечения нейродегенеративных заболеваний человека.
2) Были отработаны оптимальные методы выделения фракции мононуклеаров, содержащей стволовые клетки, из свежеполученной и криконсервированной пуповинной крови. Экспериментально было установлено, что из всех существующих методов процессинга пуповинной крови наилучшим методом для получения чистой и пригодной для дальнейшей трансфекции фракции мононуклеаров является выделение в градиенте плотности фиколла. Установлено, что криоконсервированные и свежевыделенные клетки могут быть одинаково эффективно использованы для проведения генетической модификации.
3) Одновременно были проведены работы в области генной инженерии (дизайн праймеров, клонирование и секвенирование). В результате были наработаны препаративные количества различных плазмид для трансфекции мононуклеаров.
4) На следующем этапе был проведен анализ эффективности различных методов трансфекции (химических – с трансфекционными реагентами Escort V (Sigma) и TransFast (Promega) и электрического – электропорация). Эффективность различных методов трансфекции определяли по экспрессии трэйсерного гена – ЕGFP. Во всех апробированных методах процент выхода трансфецированных клеток находился в диапазоне от 20 до 30%, и обнаружить какую-либо разницу или преимущества нам не удалось. В то же время, все дальнейшие исследования мы проводили, используя метод электропорации, основным преимуществом которой является сведение биологической вредности к минимуму по сравнению с вирус-опосредованной и химической передачей гена.
5) Через питомник лабораторных животных «Пущино» Казанский ГМУ впервые в России приобрёл трансгенных G93A мышей, экспрессирующих фенотип бокового амиотрофичесого склероза. В питомнике получено потомство и сформированы ядра. Все животные до начала экспериментов по трансплантации клеток в ретробульбарное пространство прошли генотипирование.
6) Нативные и генетически модифицированные клетки, трансфецированные генами EGFP и L1CAM+VEGF, трансплантировали мутантным G93A мышам и крысам после частичной гепатэктомии. По экспрессии специфических антигенов человека и ЕGFP, ген которого трансфецировали в клетки, удалось проследить миграцию, хоуминг и дифференцировку трансплантированных клеток в органах мишенях (головной и спинной мозг, регенерирующая печень).
7) Оценка терапевтического эффекта с использованием поведенческих тестов у G93A мышей показала преимущества генетической модификации клеток пуповинной крови по сравнению с трансплантацией нативных клеток. Ксенотрансплантация нативных и генетически модифицированных мононуклеаров не вызывала посттрансплантационных осложнений и реакции отторжения трансплантата. На момент написания отчета все животные (как экспериментальной, так и контрольной группы) находятся на стадии начала развития мышечной слабости, поэтому результаты по влиянию трансплантации генетически модифицированных клеток на продолжительность жизни G93A мышей будут получены по мере гибели животных в терминальной стадии болезни.
Развернуть

Программа

Программа "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2013 годы"

Программное мероприятие

1.2 Проведение проблемно-ориентированных поисковых исследований и создание научно-технического задела по технологиям в области наук о жизни
Продолжительность работ
2007, 8 мес.
Бюджетные средства
4,5 млн
Организация
ИОГен РАН
профинансировано
Тема
Работы по проведению проблемно-ориентированных поисковых исследований и созданию научно-технического задела в области живых систем по критической технологии «Клеточные технологии»
Продолжительность работ
2007, 8 мес.
Бюджетные средства
72 млн
Количество заявок
40
Тема
Работы по проведению проблемно-ориентированных поисковых исследований и созданию научно-технического задела в области индустрии наносистем и материалов по критической технологии «Нанотехнологии и наноматериалы» (мероприятие 1.3 Программы)
Продолжительность работ
2007 - 2008, 11 мес.
Бюджетные средства
16 млн
Количество заявок
72
Тема
Работы по проведению проблемно-ориентированных поисковых исследований и созданию научно-технического задела в области живых систем
Продолжительность работ
2007, 8 мес.
Бюджетные средства
72 млн
Количество заявок
48
Тема
Работы по проведению проблемно-ориентированных поисковых исследований и созданию научно-технического задела в области живых систем по критической технологии «Биомедицинские и ветеринарные технологии жизнеобеспечения и защиты человека и животных»
Продолжительность работ
2007, 8 мес.
Бюджетные средства
72 млн
Количество заявок
136
Тема
Работы по проведению проблемно-ориентированных поисковых исследований и созданию научно-технического задела в области живых систем по критической технологии «Геномные и посттеномные технологии создания лекарственных средств» (мероприятие 1.2 Программы)
Продолжительность работ
2007, 8 мес.
Бюджетные средства
72 млн
Количество заявок
43