Эксπир
Регистрация / Вход

Определение полной нуклеотидной последовательности гипертермофильного микроорганизма Proteinoruptor kamchatkensis с целью идентификации новых термостабильных промышленных ферментов

Стадии проекта
Предложение принято
Конкурс завершен
Проект закончен
Продолжительность работ
2007, 8 мес.
Бюджетные средства
4,5 млн
Внебюджетные средства
0,5 млн

Работы должны проводиться в рамках критической технологии «Технологии биоинженерии». Работы должны соответствовать по предполагаемому исполнению лучшим мировым стандартам. Создаваемый научно-технический задел должен обеспечивать в будущем проведение опытно-конструкторских и технологических работ на конкурентном уровне. Результаты работ должны способствовать дальнейшему инновационному развитию российских технологий в данном приоритетном направлении Программы.

Этапы проекта

1
27.02.2007 - 30.06.2007
На первом этапе работы, помимо выработки общего направления исследования, были поставлены следующие задачи:
(1) оптимизация роста штамма 1221n;
(2) получение необходимого количества клеточной массы:
(3) выделение ДНК в виде фрагментов достаточно большого размера (25 тыс. пар оснований);
(4) секвенирование фрагмента генов 16S рибосомной РНК для молекулярной идентификации изучаемого микроорганизма и определения его таксономического положения;
(5) конструирование библиотеки геномной ДНК Proteinoruptor kamchatkensis в плазмидном векторе и начало секвенирования полученных клонов.
Были выявлены оптимальные условия для культивирования штамма 1221n: органотрофный рост с 2 г/л пептона и 200 мг/л дрожжевого экстракта, в присутствии 10 г/л серы, при температуре культивирования 82оС и рН 6.5. После 18 часов культивирования в этих условиях с 3 л культуры было получено 250 мг клеток штамма 1221n. Из них нам удалось получить препарат ДНК с достаточно высоким размером фрагментов – около 25 тыс. пар нуклеотидов.
Для конструирования библиотеки случайных фрагментов из полученного препарата геномной ДНК штамма 1221n выделили и очищали две фракции фрагментов ДНК, - в диапазоне 1.5 –3 т.п.н и в диапазоне 3-6 т.п.н. Путем воздействия на препараты фрагментом Кленова ДНК полимеразы и Т4 ДНК полимеразой, инактивации ферментов нагреванием (70С – 10 мин) обработки Т4 полинуклеотидкиназой (37С – 1 час) в присутствии АТФ (1 мМ) проводили фосфирилирование 5’ концов ДНК. Результатом данного этапа работы являлось получение двух препаратов фрагментов ДНК (фракция 1.5-3 т.п.н и фракция 3-6 т.п.н), имеющих «тупые» фосфорилированные концы и пригодные к клонированию в плазмидный вектор.
Были определены нуклеотидные последовательности вставок в 10 случайно выбранных клонах. Полученные данные подтвердили пригодность библиотеки для секвенирования, - все клоны содержали вставки геномной ДНК Proteinoruptor kamchatkensis.
Развернуть
2
01.07.2007 - 31.10.2007
Были выявлены оптимальные условия для культивирования штамма 1221n: органотрофный рост с 2 г/л пептона и 200 мг/л дрожжевого экстракта, в присутствии 10 г/л серы, при температуре культивирования 82оС и рН 6.5. После 18 часов культивирования в этих условиях с 3 л культуры было получено 250 мг клеток штамма 1221n. Из них был получен препарат ДНК с достаточно высоким размером фрагментов – около 25 тыс. пар нуклеотидов.
Проведена молекулярная идентификация микроорганизма в результате определения нуклеотидной последовательности фрагмента генов 16S рибосомной РНК. Установлено, что Proteinoruptor kamchatkensis относится к Crenarchaeota и наиболее близок к роду Desulfurоcoccus. Сконструирована библиотека «случайных» фрагментов геномной ДНК Proteinoruptor kamchatkensis в плазмидном векторе, просеквенировано 10000 независимых клонов. Общий объем секвенирования составил 7,5 млн. нуклеотидов (6-кратное перекрытие генома).
В результате сборки полной геномной последовательности P. kamchatkensis из полученных фрагментов установлено, что полный размер генома этого микроорганизма составляет 1,3 млн. нуклеотидов, доля непросеквенированных участков генома составляет 2.5-3%. Анализ нуклеотидной последовательности генома P. kamchatkensis позволил идентифицировать 1585 белок-кодирующих открытых рамок считывания, а также набор генов транспортных и рибосомных РНК. Белковые продукты 795 предсказанных генов имеют значимые подобия в базе данных Swissprot, что позволяет достоверн6о предсказать функции соответствующих белков. 790 генов кодируют абсолютно новые белки, не имеющие гомологов с известными функциями.
Идентифицированы и клонированы гены, кодирующие новые термостабильные ферменты, которые могут быть использованы в различных областях медицины и промышленности, в том числе гены нескольких протеиназ разных типов, альфа-амилазы, бета-глюкозидазы, аденилсукцинат лиазы, ДНК-полимераз, ДНК-лигазы, алкогольдегидрогеназы.
Развернуть

Программа

Программа "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2013 годы"

Программное мероприятие

1.2 Проведение проблемно-ориентированных поисковых исследований и создание научно-технического задела по технологиям в области наук о жизни
Продолжительность работ
2007, 8 мес.
Бюджетные средства
4,5 млн
профинансировано
Продолжительность работ
2007, 8 мес.
Бюджетные средства
4,45 млн
Организация
ЦТП ФХФ РАН
профинансировано
Тема
Работы по проведению проблемно-ориентированных поисковых исследований и созданию научно-технического задела в области живых систем по критической технологии «Технологии биоинженерии» (мероприятие 1.2 Программы)
Продолжительность работ
2007, 8 мес.
Бюджетные средства
72 млн
Количество заявок
49
Тема
Работы по проведению проблемно-ориентированных поисковых исследований и созданию научно-технического задела в области живых систем
Продолжительность работ
2007, 8 мес.
Бюджетные средства
72 млн
Количество заявок
48
Тема
Работы по проведению проблемно-ориентированных поисковых исследований и созданию научно-технического задела в области живых систем по критической технологии «Биомедицинские и ветеринарные технологии жизнеобеспечения и защиты человека и животных»
Продолжительность работ
2007, 8 мес.
Бюджетные средства
72 млн
Количество заявок
136
Тема
Работы по проведению проблемно-ориентированных поисковых исследований и созданию научно-технического задела в области живых систем по критической технологии «Геномные и посттеномные технологии создания лекарственных средств» (мероприятие 1.2 Программы)
Продолжительность работ
2007, 8 мес.
Бюджетные средства
72 млн
Количество заявок
43
Тема
Работы по проведению проблемно-ориентированных поисковых исследований и созданию научно-технического задела в области индустрии наносистем и материалов по критической технологии «Нанотехнологии и наноматериалы» (мероприятие1.3 Программы)
Продолжительность работ
2007, 7 мес.
Бюджетные средства
92 млн
Количество заявок
241