Эксπир
Регистрация / Вход

Разработка новых вариантов ПЦР для сверхбыстрой и высокочувствительной детекции специфичных последовательностей нуклеиновых кислот по конечной точке и в реальном времени и их применение в фундаментальных исследованиях и в ДНК-диагностике

Стадии проекта
Предложение принято
Конкурс завершен
Проект закончен
Проект
02.512.11.2107
Организация
ИБГ УНЦ РАН
Руководитель работ
Вахитов Венер Абсатарович
Продолжительность работ
2007, 5 мес.
Бюджетные средства
1,2 млн
Внебюджетные средства
0 млн

В результате выполнения каждой работы должен быть создан необходимый научно-технический задел, обеспечивающий переход к проведению опытно-конструкторских работ с целью последующей коммерциализации

Этапы проекта

1
25.06.2007 - 20.11.2007
В настоящее время практически ни одна работа в молекулярной биологии, где объектами исследований являются нуклеиновые кислоты, не обходится без этапа их амплификации или высокочувствительной детекции. Что касается диагностических анализов, то и они сейчас преимущественно рассчитаны на амплификацию, главным образом, с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) специфичных фрагментов ДНК или РНК, которые могут принадлежать организмам всех уровней сложности, начиная от вирусов и заканчивая человеком. Причины столь широкого применения таких методов заключаются, с одной стороны, в скорости и относительной простоте амплификации фрагментов нуклеиновых кислот, а с другой - в их повышенной чувствительности и специфичности, благодаря чему экспериментаторы в короткие сроки могут получать достоверные результаты. Повышенный интерес к амплификации и высокочувствительной детекции нуклеиновых кислот и разработке все новых их способов объясняется еще и тем, что это в настоящее время многомиллиардный и быстро растущий бизнес.
После своего появления в середине 80-х гг. ПЦР очень быстро стала фактически методом №1 в фундаментальных исследованиях нуклеиновых кислот и в ДНК-диагностике. Вслед за ПЦР разработано немало других методов амплификации и высокочувствительной детекции специфичных фрагментов нуклеиновых кислот, но ни один из них так и не смог составить серьезной конкуренции ПЦР, несмотря на то, что некоторые сравнимы с ней по эффективности размножения молекул ДНК, однако заметно уступают ПЦР ввиду сложности их исполнения. Разработанная нами новая цепная реакция, в основе которой лежит та же ПЦР, из-за гигантских различий в эффективности была названа иначе - рекуррентной. Детекция ампликонов в ней в реальном времени основана на разработанной нами платформе "УФА" (Универсальная Флуоресцентная Амплификация), имеющей целый ряд важных преимуществ [Chemeris et al. US Patent Application Publication No 2007/0117125-A1, Oct. 26, 2006]. Причем по трудоемкости ПЦР и РЦР практически не отличаются. Для последней возможны два варианта - РЦР 2/2 и РЦР 2/1, отличающиеся тем, что в первом оба праймера представлены в виде дуплетных олигонуклеотидов (представляющих собой единую последовательность из двух одинаковых одинарных праймеров), а во втором - из пары - дуплетный только один. Первая реакция рассчитана на ускоренную детекцию ампликонов, тогда как вторая обеспечивает преимущественное накопление одной из цепей, что требуется для секвенирования ДНК. Если в ПЦР коэффициент размножения при 100%-ной эффективности реакции принципиально не может превысить значения 2, то в РЦР, благодаря использованию дуплетных праймеров и термостабильной ДНК полимеразы, обладающей смещающей цепь ДНК-активностью, он постоянно растет, достигая в варианте 2/2 к 20 циклу, например, величины 4,35 (в среднем для всех ампликонов), что и обеспечивает различия в степени амплификации между ПЦР и РЦР к этому моменту не в 2 - 3 - 5 раз, а сразу на 5 порядков. ПЦР при сравнении с РЦР 2/2 по характеру подъема кривой напоминает скорее линейную амплификацию, когда подобная сравнивается с самой ПЦР. Такая сверхразмножаемость, помимо значительного сокращения времени реакции, крайне важна для детекции единичных копий мишеней, т.к. с помощью обычной ПЦР их удается детектировать далеко не всегда, что представляет серьезную проблему. Таким образом, разработка этой новой цепной реакции, сделанная на высоком фундаментальном уровне, носит при этом ярко выраженный инновационный характер, поскольку есть все предпосылки к тому, что РЦР во многих случаях уверенно заменит ПЦР. Проведение конвекционной ПЦР с образованием наклонного градиента температур резко увеличило скорость проведения реакции, сократив ее до 1 - 2 минут против обычных часа-полутора, что очень важно для полевой диагностики. Изотермическая ПЦР имеет большой потенциал при проведении амплификации при использовании ДНК-чиповой технологии. На основе разработанных вариантов амплификации нуклеиновых кислот подобраны праймерные комбинации для детекции ряда инфекций и обнаружения транскрипционной активности ряда генов растительной и животной природы.
Развернуть

Программа

Программа "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2013 годы"

Программное мероприятие

1.2 Проведение проблемно-ориентированных поисковых исследований и создание научно-технического задела по технологиям в области наук о жизни
Продолжительность работ
2007, 5 мес.
Бюджетные средства
1,2 млн
профинансировано
Продолжительность работ
2007, 5 мес.
Бюджетные средства
1,2 млн
Организация
ИНЦ РАН
профинансировано
Тема
Работы по проведению проблемно-ориентированных поисковых исследований и созданию научно-технического задела в области живых систем по критической технологии «Клеточные технологии» (мероприятие 1.2. Программы).
Продолжительность работ
2007, 5 мес.
Бюджетные средства
15,6 млн
Количество заявок
16
Тема
Работы по проведению проблемно-ориентированных поисковых исследований и созданию научно-технического задела в области живых систем по критической технологии «Технологии биоинженерии» (мероприятие 1.2. Программы).
Продолжительность работ
2007, 5 мес.
Бюджетные средства
10,8 млн
Количество заявок
14
Тема
Работы по проведению проблемно-ориентированных поисковых исследований и созданию научно-технического задела в области живых систем по критической технологии «Биокаталитические, биосинтетические и биосенсорные технологии» (мероприятие 1.2. Программы).
Продолжительность работ
2007, 5 мес.
Бюджетные средства
4,8 млн
Количество заявок
9
Тема
Работы по проведению проблемно-ориентированных поисковых исследований и созданию научно-технического задела в области живых систем по критической технологии «Биомедицинские и ветеринарные технологии жизнеобеспечения и защиты человека и животных» (мероприятие 1.2. Программы).
Продолжительность работ
2007, 5 мес.
Бюджетные средства
18 млн
Количество заявок
40
Тема
Работы по проведению проблемно-ориентированных поисковых исследований и созданию научно-технического задела в области живых систем по критической технологии «Геномные и постгеномные технологии создания лекарственных средств» (мероприятие 1.2. Программы).
Продолжительность работ
2007, 5 мес.
Бюджетные средства
8,4 млн
Количество заявок
6