Эксπир
Регистрация / Вход

Детонационный наноалмаз: создание новых наноматериалов и нанотехнологий для выделения белков

Стадии проекта
Предложение принято
Конкурс завершен
Проект закончен
Проект
02.513.11.3079
Организация
ИБФ СО РАН
Руководитель работ
Дегерменджи Андрей Георгиевич
Продолжительность работ
2007, 7 мес.
Бюджетные средства
2 млн
Внебюджетные средства
0,11 млн

Работы должны проводиться в рамках критической технологии «Нанотехнологии и наноматериалы» Работы должны соответствовать по предполагаемому исполнению лучшим мировым стандартам. Создаваемый научно-технический задел должен обеспечивать в будущем проведение опытно-конструкторских и технологических работ на конкурентном уровне. Результаты работ должны способствовать дальнейшему инновационному развитию российских технологий в данном приоритетном направлении Программы.

Этапы проекта

1
22.03.2007 - 30.06.2007
1.1. Приобретены наноалмазы и наработаны модифицированные наноалмазы.
1.2 Наработан сорбент на основе наноалмаза, проверены его сорбционные характеристики.
1.3. Изготовлены колонки низкого давления с наноалмазным сорбентом и проведена оценка их характеристик на модельном белке (цитохром С).
1.4. Наработана биомасса штамма E. coli для проведения исследований.
1.5. Определено содержание биферментного комплекса люцифераза – НАДН:ФМН-оксидоредуктаза.
1.6. Осуществлено выделение препарата люциферазы за один технологический цикл.
1.7. Отработан оптимальный регламент выделения люциферазы с минимумом примесных белков.
1.8. Отработан регламент десорбции НАДН:ФМН-оксидоредуктазы с поверхности частиц наноалмазов.
1.9. Проверена возможность и отработан регламент одновременного выделения люциферазы и НАДН:ФМН-оксидоредуктазы за один цикл.
1.10. Проведен патентный поиск (ГОСТ 15.011-96).
1.11. Составлен промежуточный отчет.
Развернуть
2
01.07.2007 - 31.10.2007
2. Работы, выполненные на отчетном этапе:
1. Разработаны оптимальные регламенты выделения люциферазы, свободной от примесей НАДН:ФМН-оксидоредуктазы, с помощью наноалмазных материалов в объеме и колоночной хроматографией.
2. Проведены эксперименты по выделению НАД(Ф)Н:ФМН-оксидоредуктазы из биомассы светящихся бактерий V. fischeri (штамм 1231 ИБСО).
3. Наработаны ферменты в препаративных количествах согласно ТЗ.
4. Проведен патентный поиск (ГОСТ 15.011-96).
5. Обобщены результаты работы.
6. Описаны технологические процессы и регламенты выделения белков в препаративных количествах.
7. Оценена полнота решения задач и эффективности полученных результатов в сравнении с современным научно-техническим уровнем.
8. Оценена конкурентоспособность полученной продукции, разработаны рекомендации по использованию результатов проведенных НИР.
9. Подготовлены 2 заявки на патенты.
10. Подготовлены 3 проекта статей.
11. Написан итоговый отчет.


При выполнении этапа получены следующие результаты:
1. С использованием наноалмазных материалов отработаны оптимальные условия очистки изучаемого фермента - люциферазы в объеме и колоночной хроматографией, позволяющие получать препараты, имеющие по данным SDS-элетрофореза высокую степень чистоты и не содержащие примесей НАД(Ф)Н:ФМН-оксидоредуктазы - второго фермента, входящего в состав светоизлучающего биферментного комплекса, с выходом целевых продуктов 41-46% при объемном методе выделения и 35-41% при хроматографии.
2. Проведены эксперименты по выделению с помощью наноалмазных материалов НАД(Ф)Н:ФМН-оксидоредуктазы из биомассы светящихся бактерий V. fischeri (штамм 1231 ИБСО), показавшие возможность получения целевого продукта, свободного от значительной части балластных белковых примесей, и полным отсутствием люциферазы.
3. Наработаны ферменты в препаративных количествах согласно ТЗ. Для выделения люциферазы в препаративных количествах было использовано два метода. Для объемного метода выделения было взято 100 мл грубого белкового экстракта, содержащего 530 мг люциферазы (содержание фермента в препарате оценивалось по данным биолюминесцентной активности образца и рассчитывалось из калибровочной зависимости интенсивности люминесценции от количества чистого фермента), через 6 часов был получен целевой продукт в количестве 223 мг белка, который является высокоочищенным, а его выход составляет 42%. Для наработки люциферазы применяли полупрепаративную колонку (2,6 х 45 см), содержащую 240 мл упакованного сорбента. Хроматографический процесс проводили дважды, используя 45 мл и 70 мл исходного экстракта с содержанием люциферазы 121,5 мг и 189 мг соответственно (оценка проведена из зависимости люминесценции от количества чистого фермента). За одну стадию выделения наблюдается выход целевого продукта 35 и 38%, что в пересчете на количество выделенного белка для первого эксперимента составляет 42,5 мг, а для второго – 71,8 мг. Оксидоредуктаза не адсорбируется на наночастицах и поэтому отделяется от люциферазы, оставаясь в объеме. Таким образом, препарат оксидоредуктазы был получен лиофильным высушиванием не адсорбированной части белковой фракции грубого экстракта и составил 1,3мг. Содержание примесей составляет в пределах 5% от балластных белков грубого белкового экстракта.
4. Проведен патентный поиск (ГОСТ 15.011-96). Согласно его данных предлагаемые сорбенты и методы выделения являются патентночистыми. Поданы 2 заявки на изобретения.
5. Обобщены результаты работы, которые заключаются в следующем. Суммарное количество полученных препаратов составило – высокоочищенной люциферазы, полученной при масштабировании процессов выделения с помощью наноалмазных сорбентов в объеме и колоночной хроматографией 337,3 мг и 1,3 мг НАД(Ф)Н:ФМН-оксидоредуктазы, не содержащей люциферазы. Полученные целевые продукты были заморожены при температуре – 30oС, после чего проведено лиофильное высушивание. Для выполнения работ было получено 100г модифицированных наноалмазов, которые использовались для отработки технологии выделения, для наработки препаратов белков объемным методом и для создания сорбента для колоночной хроматографии. На основании разработанного сорбента было изготовлено три хроматографические колонки.
6. Описаны технологические процессы и регламенты выделения белков в препаративных количествах, которые для двух используемых методов различны. Для объемного метода - гидрозоль наноалмаза смешивают с грубым экстрактом белка, отделяют наночастиц с адсорбированным белком, промывают осадок и десорбируют целевой продукт. Для колоночной хроматографии - сорбент активируют ионами кадмия, уравновешивают стартовым буфером, наносятся грубый белковый экстракт, проводятся промывку двумя видами буферных растворов, за которыми следует десорбция выделяемого белка.
7. Оценена полнота решения задач и эффективности полученных результатов в сравнении с современным научно-техническим уровнем. Результаты проведенных исследований являются пионерскими, по литературным данным применение наночастиц различной физической природы для эффективного выделения белков не известно. Необходимо отметить, что в ходе выполнения заключительного этапа проекта был обнаружен ряд не известных ранее эффектов. На основании полученных данных можно сделать заключение, что, наноалмазы детонационного синтеза являются перспективным материалом для аналитического и препаративного выделения биологических молекул.
8. Конкурентоспособность предложенного объемного метода выделения белков с помощью наноалмазного сорбента достаточно высока и может конкурировать с широко распространенным методом колоночной хроматографии. Например, расчеты, проведенные на основании полученных данных, показывают, что за 6 часов при использовании одной центрифуги можно выделять из грубого экстракта до 2,5 грамм высокоочищенной люциферазы. При этом стоимость наноалмазного сорбента многоразового использования составляет не более 4000 рублей. Метод колоночной хроматографии является менее производительным и более дорогостоящим, т.к. при создании сорбента использовался импортный инертный носитель стоимостью 36000 руб./литр. Однако полученный результат является значимым, т.к. впервые в мировой практике получен сорбент на основе наноалмазов, способный за один технологический цикл разделять высокомолекулярные биологические соединения. НИР по разработке отечественного инертного носителя и отечественных колонок, геометрия которых адаптирована к особенностям данного сорбента, смогут снизить стоимость хроматографического процесса. Результаты проведенных НИР позволяют рекомендовать предложенные методы и материалы для применения в заинтересованных организациях.
9. Подготовлены 2 заявки на изобретения, прошедшие формальную экспертизу, получены приоритетные справки.
10. Подготовлены 3 проекта статей:
- КАТАЛИТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ НАНОАЛМАЗНЫХ ЧАСТИЦ В ОРГАНИЧЕСКИХ РЕАКЦИЯХ;
- СОРБЕНТЫ НА ОСНОВЕ НАНОАЛМАЗОВ – НОВЫЕ НОСИТЕЛИ ДЛЯ КОЛОНОЧНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ БЕЛКОВ;
- NANODIAMONDS WITH NOVEL PROPERTIES: A BIOLOGICAL STUDY.
11. Написан итоговый отчет, к которому прилагается данный документ.
Развернуть

Программа

Программа "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2013 годы"

Программное мероприятие

1.3 Проведение проблемно-ориентированных поисковых исследований и создание научно-технического задела в области индустрии наносистем
Продолжительность работ
2007, 7 мес.
Бюджетные средства
2 млн
Организация
ИГиЛ СО РАН
профинансировано
Продолжительность работ
2007, 7 мес.
Бюджетные средства
2 млн
Организация
ФГУП "ФНПЦ "Алтай"
профинансировано
Продолжительность работ
2007, 7 мес.
Бюджетные средства
2 млн
Организация
ИНХ СО РАН
профинансировано
Продолжительность работ
2007, 7 мес.
Бюджетные средства
2 млн
Организация
ИХФ РАН
профинансировано
Тема
Работы по проведению проблемно-ориентированных поисковых исследований и созданию научно-технического задела в области индустрии наносистем и материалов по критической технологии «Нанотехнологии и наноматериалы» (мероприятие1.3 Программы)
Продолжительность работ
2007, 7 мес.
Бюджетные средства
92 млн
Количество заявок
241
Тема
Работы по проведению проблемно-ориентированных поисковых исследований и созданию научно-технического задела в области индустрии наносистем и материалов по критической технологии «Нанотехнологии и наноматериалы» (мероприятие 1.3 Программы)
Продолжительность работ
2007 - 2008, 11 мес.
Бюджетные средства
16 млн
Количество заявок
72
Тема
Работы по проведению проблемно-ориентированных поисковых исследований и созданию научно-технического задела в области живых систем
Продолжительность работ
2007, 8 мес.
Бюджетные средства
72 млн
Количество заявок
48
Тема
Работы по проведению проблемно-ориентированных поисковых исследований и созданию научно-технического задела в области живых систем по критической технологии «Биомедицинские и ветеринарные технологии жизнеобеспечения и защиты человека и животных»
Продолжительность работ
2007, 8 мес.
Бюджетные средства
72 млн
Количество заявок
136
Тема
Работы по проведению проблемно-ориентированных поисковых исследований и созданию научно-технического задела в области живых систем по критической технологии «Геномные и посттеномные технологии создания лекарственных средств» (мероприятие 1.2 Программы)
Продолжительность работ
2007, 8 мес.
Бюджетные средства
72 млн
Количество заявок
43