Эксπир
Регистрация / Вход

Разработка модульных, самособирающихся нанобиочастиц, способных эффективно доставлять генотерапевтические конструкции в клетки человека

Стадии проекта
Предложение принято
Конкурс завершен
Проект закончен
Проект
02.513.11.3342
Организация
ИХБФМ СО РАН
Руководитель работ
Зенкова Марина Аркадьевна
Продолжительность работ
2007 - 2008, 14 мес.
Бюджетные средства
1,5 млн
Внебюджетные средства
1,6 млн

Информация отсутствует

Этапы проекта

1
01.08.2007 - 31.10.2007
Проведен анализ научно-технической литературы, относящейся к разрабатываемой теме. Разработаны системы олигонуклеотидов, способных к формированию супрамолекулярных комплексов в физиологических условиях. Выбрана серия перспективных молекул транспортеров из числа соединений, синтезированных ранее в ИХБФМ СО РАН и исследована их токсичность по отношению к эукариотическим клеткам разного тканевого происхождения. Создан универсальный вектор pEBFP-N1(3) для экспрессии shРНК в клетках человека. На его основе сконструирован вектор pEBFP-N1(3)-shD, экспрессирующий shРНК, направленную на мРНК гена MDR1 человека. Показано, что введение этого вектора в клетки обеспечивает экспрессию shРНК и вызывает эффективное и высокоспецифичное подавление экспрессии гена MDR1. Проведенный патентный анализ по тематике, связанной с работой по проекту, показал, что модульные, самособирающиеся нанобиочастицы, способные эффективно доставлять генотерапевтические конструкции в клетки человека, создание которых предусмотрено настоящим проектом, пригодны для массового коммерческого распространения в основных секторах рынка биотехнологической и биомедицинской индустрии и в университетах для исследовательских целей.
Развернуть
2
01.11.2007 - 31.12.2007
Проведены физико-химические исследования образования олигонуклеотидами с взаимоперекрывающимися комплементарными последовательностями протяженных двуцепочечных структур – конкатемерных комплексов. Показано, что конкатемеры наибольшего размера образуются при эквимолярном соотношении доставляемого олигонуклеотида и олигонуклеотида-носителя. Исследовано влияние присутствия объемной липофильной группы на конце олигонуклеотида на стабильность образующихся комплексов. Данные показали, что присутствие холестерина на концах олигонуклеотида, образующего одну из цепей дуплекса, не дестабилизирует комплекс в заметной степени. Исследована способность катионных молекул-транспортеров к мицеллообразованию. Показано, что критическая концентрация мицеллообразования зависит от длины гидрофобного фрагмента и мольного соотношения гидрофобных и гидрофильных составляющих амфифильной молекулы. Для получения коньюгатов олигонуклеотидов-транспортеров с лигандами-транспортерами различных типов разработаны следующие химические стратегии: (1) присоединение лигандов, содержащих альдегидную группу к аминосодержащему олигонуклеотиду; (2) присоединение лигандов, содержащих алифатическую аминогруппу к 5’- концевому фосфату олигонуклеотида; (3) присоединение аминосодержащих лигандов через взаимодействие с альдегидной группой, полученной путем окисления 2`-диольной группы, введенной в олигонуклеотид при твердофазном синтезе. Данные стратегии использованы для получения конъюгатов олигонуклеотидов с холестерином.
Развернуть
3
01.01.2008 - 30.06.2008
Изучено образование и биологическая активность нанокомплекмов холестерин-модифицированных олигонуклеотидов и их взаимодействие с опухолевыми клетками различного происхождения. В ходе выполнения проекта показана возможность образования супрамолекулярных комплексов, состоящих из молекул шпилечных РНК. Показано, что эффективность образования нанокомплексов РНК увеличивается с увеличением времени инкубации и концентрации исходных РНК в растворе.
Обнаружено, что присоединение к 5`-концам цепей ДНК холестерина облегчает проникновение ДНК кассет в клетки. Сравнение эффективности накопления кассет в клетках HEK293 и HepG2 показало, что в обеих клеточных линиях кассеты с холестерином накапливаются эффективнее, чем не модифицированные кассеты, более того, кассеты накапливаются в клетках более эффективно в присутствии сыворотки. Эти данные позволяют предположить, что проникновение холестерин-содержащих кассет происходит за счет увеличения эффективности эндоцитоза изучаемых нанобиоструктур за счет гидрофобизации.
Развернуть
4
01.07.2008 - 31.10.2008
Исследовано проникновение полученных на предыдущих этапах проекта нанобиочастиц в клетки человека, изучена их локализация в клетках и определена биологическая активность.
Показано, что доставка антисмыслового олигонуклеотида в клетки опухолевых линий человека в форме конкатемера приводит к специфическому подавлению экспрессии гена мишени, в результате происходит снижение уровня мРНК гена-мишени на 46%.
Показано, что конъюгаты полиэтиленимина с холестерином (PEIС) с низкой степенью модификации холестерином (менее 5%) более эффективно доставляют НК в клетки, чем немодифицированный PEI и его конъюгаты с холестерином со степенью модификации более 5%.
Обнаружено, что деацитилированные PEI способствуют эффективному проникновению олигонуклеотидов в клетки HeLa, при этом полимеры с молекулярной массой 87 и 217 кДа более эффективно доставляют олигонуклеотиды в клетки, чем полимеры с массой 22 - 25 кДа.
Из серии соединений аналогов поликатионного липида DOSPA, входящего в состав широко используемого катионного агента Lipofectamine™, отобраны липиды D1 и Х3, которые эффективно доставляют нуклеиновые кислоты в клетки.
В качестве кандидатных систем для конструирования нанобиочастиц для испытания in vivo предложено использовать конкатемерные комплексы нуклеиновых кислот и конъюгаты полиэтиленимина с холестерином с низкой степенью модификации холестерином (менее 5%).
Проведен анализ результатов исследований и оценка их эффективности в сравнении с современным научно-техническим уровнем. Авторами проекта впервые показано эффективное проникновение в клетки в отсутствие дополнительных трансфецирующих агентов олигонуклеотидов в составе конкатемерных комплексов, в состав которых входят холестерин-модифицированные олигонуклеотиды носители, и проявление ими биологического эффекта. В качестве эффективных поликатионных доставщиков авторами проекта предложены конъюгаты полиэтиленимина с холестерином (PEIС) с низкой степенью модификации холестерином (менее 5%).
Развернуть

Программа

Программа "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2013 годы"

Программное мероприятие

1.3 Проведение проблемно-ориентированных поисковых исследований и создание научно-технического задела в области индустрии наносистем
Продолжительность работ
2007, 8 мес.
Бюджетные средства
4,5 млн
Организация
ИМБ РАН
профинансировано
Тема
Генотерапия СПИДа с помощью РНК-интерференции: создание эффективно работающих генетических конструкций для подавления продукции ВИЧ-1 в клетках человека
Продолжительность работ
2005 - 2006, 23 мес.
Бюджетные средства
3 млн
Количество заявок
2
Тема
Микрореакторы с адаптогенным управлением на основе бактериальной клетки для диагностики патологических состояний человека.
Продолжительность работ
2009 - 2010, 17 мес.
Бюджетные средства
7 млн
Количество заявок
1
Тема
Доклинические исследования противомеланомного препарата, созданного на основе самособирающегося слитого белка, содержащего меланома-узнающие пептиды и адапторную часть для присоединения токсического агента.
Продолжительность работ
2012 - 2014, 24 мес.
Бюджетные средства
33 млн
Количество заявок
1
Тема
Разработка отечественного набора ДНК-маркеров для ДНК-идентификации человека.
Продолжительность работ
2008 - 2009, 17 мес.
Бюджетные средства
7,8 млн
Количество заявок
2
Тема
Разработка новой теплоизоляционной конструкции для защиты оборудования, эксплуатирующегося при температурах до 700°С
Продолжительность работ
2014 - 2016, 26 мес.
Бюджетные средства
100 млн
Количество заявок
4